Redoks kofaktör rejenerasyonu manipülasyonuyla büyümeye bağlı enzim mühendisliği

Biyoteknolojik yöntemlerle yenilenebilir hammaddelerden giderek daha geniş bir kimyasal yelpazesi üretilmektedir. Biyoprosesler, bu bileşiklerin verimli üretimi için enzimatik katalize büyük ölçüde dayanır. Bu nedenle, enzimlerin gerekli ortamlarında en iyi şekilde performans göstermesini sağlamak sürdürülebilir üretim için büyük ilgi taşır.

Substrat özgüllüğü, katalitik hız ve (termo)stabilite gibi özellikler, verimli enzim odaklı biyosüreçler için optimize edilmesi gereken birkaç kritik faktör arasındadır. Bu optimizasyon zaman alıcı, maliyetli ve zorlu olabilir; bu nedenle büyüme bağlantılı seçim için etkili ve maliyet verimli yollar olabilir; arzu edilen özelliklere sahip mühendislik enzimleri çok aranan bir yöntemdir.

Büyüme ile bağlı seçilimin enzim seçimi biçimi olarak kullanılmasının avantajları; bu yöntem, bir enzimin aktivitesini bir hücrenin büyümesine bağlamayı içerir. Bu yöntem, yüksek verimlilikte bir seçim stratejisi olarak kullanılabilir ve büyümenin hedef enzimin ürün sentezine bağlı olmasını sağlamak ya da enzimin aktivitesini hücrenin küresel enerji durumuna bağlamak yoluyla sağlanabilir. Sentetik biyoloji, büyüme bağlantılı seçim için uygun suşlar tasarlamak için kullanılabilir ve son gelişmeler, redoks kofaktör çiftlerinin oksitlenmiş veya indirgenmiş hallerinde eksik olan mühendislik suşlarına odaklanmıştır; bu suşlar enzim mühendisliği platformları olarak hizmet verebilir. Bu platformların kullanımı, geliştirilmiş biyokatalizörlerin ve biyoproseslerin gelişimini hızlandırabilir.

Kofaktör auksotrofi ile büyüme birleşmesinin faydaları

Lipidler, biyoyakıtlar, gazlar, organik çözücüler veya polimerik bileşikler gibi bazı kimyasalların biyosentezinde rol alan enzimlerin mühendisliği için kofaktör auksotrofi'nin seçim yöntemi olarak kullanılmasının faydaları. Bu yaklaşım, ilgilenilen substrat veya üründen bağımsız olarak istenen ürünü seçebilme imkanı, gelişmiş enzimatik aktiviteyi tespit etmeyi kolaylaştırmak ve gelişmiş enzimatik aktiviteyi tespit etmek için bir okuma sunmak gibi birçok benzersiz fayda sunar. Ayrıca, kofaktör auksotrofların büyüme bağlama platformları olarak kullanılması faydalıdır çünkü mikrobiyal metabolizmada redoks kofaktorlarının her yerde bulunması, mühendislik stratejilerinin ilgi çeken diğer mikroplara yansal olarak aktarılabilir olmasını ve enzimlerin istenen mikrobiyal konak ortamında doğrudan mühendislik yapılmasını sağlar. (Şekil 1 olarak gösterilmiştir)

Şekil 1: Enzim mühendisliği için yaygın olarak kullanılan birkaç tarama/seçim tekniğinin karşılaştırması

NADH oksidasyonunda eksik mutantlar

E. coli'de NADH'nin oksidasyonu, oksijen bulunabilirliğine bağlı olarak iki yoldan gerçekleşebilir. Aerobik koşullarda, NADH esas olarak solunum yoluyla oksitlenerek ATP üretirken, anaerobik koşullarda fermentasyon yolları yoluyla oksitlenerek laktat ve etanol üretebilir. Anaerobik büyüme sırasında NADH oksidasyonu için karışık fermantasyon yollarını kullanamadıkları için mutant E. coli suşları, 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butandiol, 1-butanol ve L-alanin gibi çeşitli kimyasalların anaerobik sentezi için NADH oksitleyici yollarını çalıştırmak için kullanılmıştır. Bu mutant suşlar, benzer redoks prensipleri kullanılarak enzimlerin mühendisliğinde de kullanılmış ve bu da gelişmiş varyantlar ortaya çıkmıştır. Ortaya çıkan suşlar, diğer NAD(P)H'ye bağımlı enzimler ve yollar geliştirmek için kullanılabilir.

NAD+ indirgemesi eksik mutantlar  

Wenk ve ark. dihidrolipoyl dehidrojenaz (lpd) genini silerek bir E. coli suşu oluşturmuştur; bu durum, piruvat dehidrojenaz aktivitesinin olmaması nedeniyle asetat metabolizmasından indirgeme gücü (NADH ve NADPH) üretememesine yol açmıştır. Bu durum, suşun sadece bir karbon kaynağı olarak asetat üzerinde aerobik olarak yetiştirildiğinde gücü azaltmak için auxotrofi göstermesine neden oldu. (şekil 2 olarak gösterilmiştir) Suş, üst glikolitik substratlarla takviye edildiğinde veya NAD+'a bağlı format-, etanol veya metanol dehidrojenazları ilgili substratlarıyla eksprese edildiğinde asetat üzerinde büyüyebiliyordu. Bu suş enzim mühendisliği için kullanılmadı ve sadece redoks kofaktör auxotrofi açısından değerlendirildi.
 

Şekil 2: Merkezi Metabolizma 

NADPH oksidasyonunda eksik mutantlar

E. coli'de NADP+ auxotrofisini indüklemek için iki farklı strateji vardır; bunlar, NADPH'yi aşırı üretecek glikolitik yolun mühendisliğine dayanır. İlk strateji, doğal gapA geninin silinmesini ve heterologik bir NADP+-bağımlı GAPDH enziminin ifade edilmesini içerirken, ikinci strateji karbon akışını pentoz fosfat yolu üzerinden yönlendirmektir. Ortaya çıkan suşlar glikoz üzerinde büyüyemez, ancak farklı koşullarda büyüme gösterir; ilk suş anaerobik koşullarda, ikincisi ise aerobik koşullarda gliserol olarak alt tabaka olarak yetiştirilir. Bu suşlar, substrat özgüllüğü, katalitik aktivite ve termostabilite gibi gelişmiş özelliklere sahip enzimlerin mühendisliği için kullanılır.

NADP+ indirgemesi eksik mutantlar

Üç farklı bakteri, E. coli, P. putida ve C. glutamicum, NADPH-auxotrofik olarak tasarlanmış, yani büyümek için dışsal NADPH'ye ihtiyaç duymaktadırlar. E. coli ve C. glutamicum örneğinde, glikoz karbon kaynağı olarak sağlandığında NADP+ indirgenmesini önlemek için merkezi metabolik enzimler dışarı atıldı; P. putida'da ise CRISPR/nCas9 destekli mühendislik kullanılarak hedef gen setlerinin sıralı olarak bozularak redoks metabolizmasındaki rollerini anlamak sağlandı. NADPH-auxotrofik suşlar, kofaktör özgüllüğüne dayalı büyüme-bağlı enzim mühendisliği için kullanıldı. E. coli kullanılarak yapılan tek bir mutajenez turu, bugüne kadar en verimli ve özgül NADP+ bağımlı format dehidrojenazı elde etti; P. putida ve C. glutamicum, bu tür mühendislik için kullanılabilecek türlerinin ilk suşlarını temsil eder.

NMN+ indirgemesi eksik mutantlar

NMN+ indirgenmesi eksikliğine dayalı olarak kofaktör döngüsü ile büyümeyi birbirine bağlamak için büyümeye bağlı bir seçim sistemi geliştirilmiştir. E. coli SHuffle suşu kullanılmıştır; bu suş, indirgenmiş glutatyon üretiminde yer alan iki gende delesyonlar taşır. Rasyonel mutagenez yoluyla NMN+/NMNH döngüsüyle ilişkilendirilen bir NMNH-bağımlı glutatyon redüktazı, NMN+/NMNH döngüsü ve dolayısıyla büyümeyi desteklemek için NMN+-bağımlı bir glukoz dehidrojenaz kullanıldı. Çalışmada ayrıca büyüme-bağlı enzim mühendisliği için ilk kez kanonik olmayan redoks kofaktör ooksotrofi uygulandı ve bu da in vitro olarak gelişmiş katalitik verimlilik ve zamansal stabilitere sahip termostabil fosfit dehidrojenaz varyantı ortaya çıktı. Bu çalışma, büyüme-bağlı enzim mühendisliği için faydalı bir suş sağlar; NMN+/NMNH döngüsü ve kanonik olmayan bir redoks kofaktörünün indirgenmiş hali için auksotrofik bir duruma bağlıdır.

Redoks kofaktörler aracılığıyla büyüme-bağlanma potansiyeli, özellikle sürdürülebilir biyoüretim bağlamında biyokatalizör mühendisliği için güçlü bir araç olarak çalıştı. Redoks kofaktör auksotrofik suşların üretiminde önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, bu açıklama hâlâ keşfedilmemiş birkaç araştırma yolu olduğunu öne sürüyor. Bunlardan biri, E. coli dışındaki organizmaların kofaktör kofaktör suşlarının mühendisliğini içermek, büyüme bağlantılı enzim mühendisliği için yeni olanaklar açabilir.

Genel olarak, redoks kofaktör tabanlı büyüme-bağlanmanın kullanımının, özellikle diğer yüksek verimli enzim mühendisliği yaklaşımlarının gereksinimlerini karşılayamayan ürünlerin üretimi için biyokataliz mühendisliği için büyük bir fırsat olduğunu öne sürmektedir. Sürdürülebilir biyoüretim için daha çok yönlü ve verimli biyokatalizörlerin geliştirilmesinin gerekliliğini vurguluyor ve bu alanda araştırmaların devam etmesinin önemini vurgulamaktadır.


Kaynak: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Redoks kofaktör rejenerasyonu manipülasyonu yoluyla büyümeye bağlı enzim mühendisliği, Biotechnology Advances, 2023.