Redoks kofaktör rejenerasyonunun manipülasyonu yoluyla büyümeye bağlı enzim mühendisliği
Redoks kofaktör rejenerasyonunun manipülasyonu yoluyla büyümeye bağlı enzim mühendisliği
Giderek artan sayıda kimyasal madde artık yenilenebilir hammaddelerden biyoteknolojik yollarla üretilmektedir. Biyoprosesler, bu bileşiklerin verimli üretimi için büyük ölçüde enzimatik katalize dayanır. Bu nedenle enzimlerin gerekli ortamda optimum performans göstermesini sağlamak, sürdürülebilir üretim için büyük önem taşımaktadır.
Substrat spesifikliği, katalitik hız ve (termo)stabilite gibi özellikler, verimli enzim kaynaklı biyoprosesler için optimize edilmesi gereken birkaç kritik faktör arasındadır. Bu optimizasyon zaman alıcı, maliyetli ve zorlu olabilir; bu nedenle, büyümeye bağlı seçilim için etkili ve uygun maliyetli yollar ve arzu edilen özelliklere sahip enzimlerin mühendisliği büyük ölçüde aranmaktadır.
Büyümeye bağlı seçilimin bir enzim seçilim biçimi olarak kullanılmasının avantajları, bir enzimin aktivitesini bir hücrenin büyümesine bağlamayı içerir. Bu yöntem, yüksek verimli bir seçilim stratejisi olarak kullanılabilir ve ya büyümenin hedef enzim tarafından ürün sentezine bağımlı hale getirilmesiyle ya da enzimin aktivitesinin hücrenin global enerji durumuna bağlanmasıyla elde edilebilir. Sentetik biyoloji, büyümeye bağlı seçilime uygun suşların mühendisliği için kullanılabilir ve son gelişmeler, enzim mühendisliği platformları olarak hizmet edebilecek redoks kofaktör çiftlerinin oksitlenmiş veya indirgenmiş durumlarında eksik olan suşların mühendisliğine odaklanmıştır. Bu platformların kullanımı, geliştirilmiş biyokatalizörlerin ve biyoproseslerin gelişimini hızlandırabilir.
Kofaktör oksotrofisi yoluyla büyüme bağlanmasının faydaları
Lipitler, biyoyakıtlar, gazlar, organik çözücüler veya polimerik bileşikler gibi belirli kimyasalların biyosentezinde yer alan enzimlerin mühendisliği için bir seçilim yöntemi olarak kofaktör oksotrofisi kullanmanın faydaları. Bu yaklaşım, ilgili substrat veya üründen bağımsız olarak istenen ürün için seçilim yapabilme, gelişmiş enzimatik aktiviteyi tespit etmeyi kolaylaştırma ve gelişmiş enzimatik aktiviteyi tespit etmek için bir okuma sunma dahil olmak üzere birkaç benzersiz fayda sunar. Ek olarak, kofaktör oksotroflarının büyüme bağlama platformları olarak kullanılması faydalıdır çünkü redoks kofaktörlerinin mikrobiyal metabolizmada yaygın doğası, mühendislik stratejilerinin ilgili diğer mikroplara yanal olarak aktarılabilmesi ve enzimlerin doğrudan istenen mikrobiyal konakçının ortamında mühendisliklenebilmesi anlamına gelir. (şekil 1'de gösterilmiştir)
Şekil 1: Enzim mühendisliği için yaygın olarak kullanılan birkaç tarama/seçilim tekniğinin karşılaştırılması
NADH oksidasyonunda eksik olan mutantlar
E. coli'de NADH oksidasyonu, oksijen mevcudiyetine bağlı olarak iki yoldan gerçekleşebilir. Aerobik koşullar altında, NADH esas olarak ATP üretmek için solunum yoluyla oksitlenirken, anaerobik koşullar altında laktat ve etanol üretmek için fermentasyon yollarıyla oksitlenebilir. Anaerobik büyüme sırasında NADH oksidasyonu için karışık fermentasyon yollarını kullanamayan E. coli mutant suşları, 2-metilpropan-1-ol, 2,3-bütanediol, 1-bütanol ve L-alanin gibi çeşitli kimyasalların anaerobik sentezi için NADH oksitleyen yolları yönlendirmek için kullanılmıştır. Bu mutant suşlar ayrıca benzer redoks prensiplerinden yararlanarak enzim mühendisliği için kullanılmış ve geliştirilmiş varyantlar elde edilmiştir. Elde edilen suşlar, diğer NAD(P)H bağımlı enzimleri ve yolları mühendisliklemek için kullanılabilir.
NAD+ indirgenmesinde eksik olan mutantlar
Wenk ve arkadaşları, dihidrolipoil dehidrojenaz (lpd) genini silerek bir E. coli suşu oluşturmuş ve bu suş, piruvat dehidrojenaz aktivitesinin yokluğu nedeniyle asetat metabolizmasından indirgeme gücü (NADH ve NADPH) üretemez hale gelmiştir. Bu, suşun tek karbon kaynağı olarak asetat üzerinde aerobik olarak büyütüldüğünde indirgeme gücü için oksotrofi sergilemesine neden olmuştur. (şekil 2'de gösterilmiştir) Suş, üst glikolitik substratlarla takviye edildiğinde veya NAD+ bağımlı format-, etanol- veya metanol dehidrojenazları kendi substratlarıyla eksprese ettiğinde asetat üzerinde büyüyebilmiştir. Suş, enzim mühendisliği için kullanılmamış ve yalnızca redoks kofaktör oksotrofisi için değerlendirilmiştir.
Şekil 2: Merkezi Metabolizma
NADPH oksidasyonunda eksik olan mutantlar
E. coli'de NADP+ oksotrofisi oluşturmak için, glikolitik yolu NADPH'yi aşırı üretecek şekilde mühendisliklemeye dayanan iki farklı strateji vardır. İlk strateji, doğal gapA genini silmeyi ve heterolog bir NADP+ bağımlı GAPDH enzimi eksprese etmeyi içerirken, ikinci strateji karbon akışını pentoz fosfat yoluna yönlendirmeyi içerir. Elde edilen suşlar glikoz üzerinde büyüyemez ancak farklı koşullarda büyüme gösterir; ilk suş anaerobik koşullar altında, ikincisi ise gliserol substratı ile aerobik koşullar altında büyütülür. Bu suşlar, substrat spesifikliği, katalitik aktivite ve termostabilite dahil olmak üzere gelişmiş özelliklere sahip enzimlerin mühendisliği için kullanılır.
NADP+ indirgenmesinde eksik olan mutantlar
E. coli, P. putida ve C. glutamicum olmak üzere üç farklı bakteri, büyüme için eksojen NADPH gerektirdikleri anlamına gelen NADPH-oksotrofik olacak şekilde mühendisliklenmiştir. E. coli ve C. glutamicum durumunda, glikoz karbon kaynağı olarak sağlandığında NADP+ indirgenmesini önlemek için merkezi metabolik enzimler nakavt edilirken, P. putida'da redoks metabolizmasındaki katılımlarını anlamak için hedef gen setlerini sırayla bozmak için CRISPR/nCas9 destekli mühendislik kullanılmıştır. NADPH-oksotrofik suşlar daha sonra kofaktör spesifikliğine dayalı büyümeye bağlı enzim mühendisliği için kullanılmıştır. E. coli kullanılarak yapılan tek bir mutagenez turu, bugüne kadarki en verimli ve spesifik NADP+ bağımlı format dehidrojenazı üretirken, P. putida ve C. glutamicum, bu tür mühendislik için kullanılabilen türlerinin ilk suşlarını temsil etmektedir.
NMN+ indirgenmesinde eksik olan mutantlar
NMN+ indirgenmesindeki bir eksikliğe dayalı olarak kofaktör döngüsünü ve büyümeyi birbirine bağlayan büyümeye bağlı bir seçim sistemi geliştirildi. İndirgenmiş glutatyon üretiminde rol oynayan iki gende delesyon taşıyan E. coli SHuffle suşu kullanıldı. Süreci NMN+/NMNH döngüsüne bağlamak için rasyonel mutagenez yoluyla NMNH'ye bağımlı bir glutatyon redüktaz geliştirildi ve NMN+/NMNH kofaktör döngüsünü ve dolayısıyla büyümeyi desteklemek için NMN+'ya bağımlı bir glikoz dehidrojenaz kullanıldı. Çalışma ayrıca ilk kez büyümeye bağlı enzim mühendisliği için kanonik olmayan redoks kofaktörü oksotrofisini uyguladı ve in vitro olarak iyileştirilmiş katalitik verimlilik ve zamansal stabiliteye sahip termostabil bir fosfit dehidrojenaz varyantı elde edildi. Bu çalışma, NMN+/NMNH döngüsüne bağımlı ve kanonik olmayan bir redoks kofaktörünün indirgenmiş durumu için oksotrofik olan, büyümeye bağlı enzim mühendisliği için yararlı bir suş sağlamaktadır.
Redoks kofaktörleri aracılığıyla büyüme bağlanmasının potansiyeli, özellikle sürdürülebilir biyoüretim bağlamında biyokatalizörleri mühendislik etmek için güçlü bir araç olarak çalıştı. Redoks kofaktörü oksotrofik suşların üretiminde önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, ifade araştırma için hala birkaç keşfedilmemiş yol olduğunu göstermektedir. Bunlardan biri, E. coli dışındaki organizmaların kofaktör oksotrofik suşlarının mühendisliğini içerir ve bu da büyümeye bağlı enzim mühendisliği için yeni olanaklar açabilir.
Genel olarak, redoks kofaktörü tabanlı büyüme bağlanmasının kullanımının, özellikle diğer yüksek verimli enzim mühendisliği yaklaşımlarının gereksinimlerini karşılayamayan ürünlerin üretimi için biyokataliz mühendisliğinde büyük bir fırsatı temsil ettiğini öne sürmektedir. Sürdürülebilir biyoüretim için daha çok yönlü ve verimli biyokatalizörler geliştirme ihtiyacını vurgulamakta ve bu alanda sürekli araştırmanın önemini vurgulamaktadır.
Referans: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Büyümeye bağlı enzim mühendisliği, redoks kofaktör rejenerasyonunun manipülasyonu yoluyla, Biotechnology Advances, 2023.
