Stevia Rebaudioside D'nin Yüksek Verimine Ulaşmak İçin Reaksiyon Koşullarının Optimize Edilmesi
Yüksek şekerli diyetler, obezite, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve hipertansiyon gibi çeşitli kronik hastalıkların yaygınlığının artmasına yol açmış ve bu da önemli bir küresel halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır. Bitkilerden elde edilen doğal bir tatlandırıcı olan Stevia Rebaudioside D (Reb D), sıfır kalori içeriği, yoğun tatlılığı ve hoş tat profili nedeniyle şeker ikameteri olarak önemli ilgi görmüştür.
Ancak, stevia rebaudiana Bertoni'deki sınırlı varlığı ve bitkisel kaynaklı glikosiltransferazın düşük çözünürlüğü ve enzimatik aktiviteleriyle ilgili zorluklar, yaygın ticari uygulamasını engellemiştir. Bu sorunlara yanıt olarak, Bacillus subtilis 168'den kaynaklanan yeni bir glikosiltransferaz olan YojK keşfedilmiştir. Bu çalışma, yüksek çözünürlüğü ve katalitik verimliliğiyle karakterize edilen, endüstriyel ölçekte Reb D üretimi için büyük potansiyel sunan genetik olarak değiştirilmiş bakteriyel glikosiltransferaz YojK-I241T/G327N tanıtmaktadır.
YojK-I241T/G327N ve AtSuSy enzimlerinin kaskad reaksiyonu kullanılarak rebaudiosid D üretimi için yüksek verimli bir yöntemin geliştirilmesi.
Bitki kaynaklı glikosiltransferazlarda düşük çözünürlük sorununu çözmek için araştırmacılar, Bacillus subtilis 168'den alınan bir O-glikosiltransferaz olan YojK'nin kullanımının potansiyelini araştırdılar. YojK, büyük moleküller dahil olmak üzere çeşitli substratlarla gösterilen glikozilasyon aktivitesi nedeniyle seçildi. Başarılı rekombinant ifade ve saflaştırmadan sonra, YojK Reb A'yı glikozilasyon için kullandı ve bu da Stevia Reb D üretimine yol açtı. Enzim kinetik analizi, YojK'nın diğer glikosiltransferazlara kıyasla Reb D'ye yönelik daha düşük katalitik aktiviteye sahip olduğunu ortaya koydu. Sonuç olarak, çalışma, YojK'nin potansiyel pratik uygulamalar için katalizör aktivitesini artırmak için yapı rehberli mühendisliğin gerekliliğini öne sürmektedir. (Şekil 1'de gösterildiği gibi)
Şekil 1
Rebaudioside D'nin yüksek verimini elde etmek için reaksiyon koşullarının optimize edilmesi.
Reaksiyon koşulları, pH, sıcaklık ve substrat konsantrasyonu dahil olmak üzere, yüksek Srevia Reb D verimi elde edilmek için optimize edilebilir. Çalışma, YojK-I241T/G327N varyantının Reb D glikozilasyonunu nasıl artırdığını araştırmak için moleküler dinamik simülasyonları kullandı. Bu varyant, simülasyonlar sırasında Reb A ile H14 arasında kararlı bir hidrojen bağı korudu; wild-tipin aksine, Şekil 2'de gösterildiği gibi. Bu kararlılık, Reb A'nın O2 atomu ile UDPG'nin C1P'si arasındaki mesafeye de uzandı. YojK-I241T/G327N varyantının geliştirilmiş katalitik verimliliği, bu kararlı etkileşimlere atfedildi ve bu da pratik potansiyelini gösteriyordu.
Şekil 2
Şekil 3
Sonuç
Bu yaklaşım %83,47 Reb D verdi. Özellikle, 1 mM UDPG eklemek, 20,59 g/L Reb D sentezini ve dikkat çekici %91,29 verimle önceki çalışmaları aştı. Bu süreç, özellikle YojK'nın yapısal mühendisliği sonrası endüstriyel ölçekli Reb D üretiminin potansiyelini göstermektedir.YojK, yüksek çözünürlüğüyle E. coli BL21 (DE3) içinde verimli şekilde ifade edilebilir. Yapı rehberli mühendislik sayesinde, çift mutant olan YojK-I241T/G327N oluşturuldu ve bu sayede SuSy tarafından katalize edilen UDPG geri dönüştürülerek %91,29 olağanüstü verimle büyük ölçekli Reb D üretimi mümkün oldu. Bu çalışma, YojK-I241T/G327N'yi ekonomik olarak etkili endüstriyel ölçekli Reb D üretimi için umut vadeden bir araç olarak sunmaktadır.
