Stevia Rebaudioside D'nin Yüksek Verimini Elde Etmek için Reaksiyon Koşullarının Optimizasyonu
Yüksek şekerli diyetler; obezite, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli kronik hastalıkların yaygınlığının artmasına yol açarak küresel bir halk sağlığı sorunu oluşturmuştur. Bitkilerden elde edilen doğal bir tatlandırıcı olan Stevia Rebaudioside D (Reb D), sıfır kalorili içeriği, yoğun tatlılığı ve hoş tat profili nedeniyle şeker ikamesi olarak önemli bir ilgi görmüştür.
Ancak, stevia rebaudiana Bertoni'deki sınırlı varlığı ve bitki kaynaklı glikosiltransferazın düşük çözünürlüğü ve enzimatik aktivitesi ile ilgili zorluklar, yaygın ticari uygulamasını engellemiştir. Bu sorunlara yanıt olarak, Bacillus subtilis 168'den köken alan YojK adlı yeni bir glikosiltransferaz keşfedilmiştir. Bu çalışma, yüksek çözünürlük ve katalitik verimlilik ile karakterize edilen, Reb D'nin endüstriyel ölçekte üretimi için büyük potansiyel sunan genetiği değiştirilmiş bir bakteriyel glikosiltransferaz olan YojK-I241T/G327N'yi tanıtmaktadır.
YojK-I241T/G327N ve AtSuSy enzimlerinin kaskad reaksiyonu kullanılarak rebaudioside D üretimi için oldukça verimli bir yöntemin geliştirilmesi.
Bitki kaynaklı glikosiltransferazların düşük çözünürlük sorununu ele almak için araştırmacılar, Bacillus subtilis 168'den bir O-glikosiltransferaz olan YojK'nın kullanılma potansiyelini araştırmışlardır. YojK, büyük moleküller dahil olmak üzere çeşitli substratlarla gösterilen glikosilasyon aktivitesi nedeniyle seçilmiştir. Başarılı rekombinant ekspresyon ve saflaştırmanın ardından YojK, Reb A'yı glikosile etmek için kullanılmış ve Stevia Reb D üretimi sağlanmıştır. Enzim kinetik analizi, YojK'nın Reb D'ye karşı diğer glikosiltransferazlara kıyasla daha düşük katalitik aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymuştur. Sonuç olarak çalışma, potansiyel pratik uygulamalar için YojK'nın katalitik aktivitesini artırmak amacıyla yapı temelli mühendislik gerekliliğini önermektedir. (Şekil 1'de gösterildiği gibi)
Şekil 1
Yüksek verimde rebaudioside D elde etmek için reaksiyon koşullarının optimizasyonu.
pH, sıcaklık ve substrat konsantrasyonu dahil olmak üzere reaksiyon koşulları, yüksek verimde Stevia Reb D elde etmek için optimize edilebilir. Çalışma, YojK-I241T/G327N varyantının Reb D glikosilasyonunu nasıl artırdığını araştırmak için moleküler dinamik simülasyonları kullanmıştır. Varyant, simülasyonlar sırasında Reb A ile H14 arasında stabil bir hidrojen bağı korumuştur; vahşi tipin aksine (Şekil 2'de gösterildiği gibi). Bu stabilite, Reb A'nın O2 atomu ile UDPG'nin C1P'si arasındaki mesafeye de uzanmıştır. YojK-I241T/G327N varyantının iyileştirilmiş katalitik verimliliği bu stabil etkileşimlere atfedilmiş ve pratik potansiyelini düşündürmüştür.
Şekil 2
Şekil 3
Sonuç
Bu yaklaşım %83,47 Reb D verimi sağlamıştır. Özellikle, 1 mM UDPG eklenmesi, önceki çalışmaları aşan dikkate değer bir %91,29 verimle 20,59 g/L Reb D sentezine olanak tanımıştır. Bu süreç, özellikle YojK'nın yapısal mühendisliğinden sonra endüstriyel ölçekte Reb D üretimi potansiyelini göstermektedir.YojK, E. coli BL21 (DE3)'te yüksek çözünürlükle verimli bir şekilde eksprese edilebilir. Yapı temelli mühendislik yoluyla, sükroz sentaz AtSuSy tarafından katalize edilen UDPG'nin geri dönüştürülmesiyle %91,29'luk olağanüstü bir verimle Reb D'nin büyük ölçekli üretimini sağlayan çift mutant YojK-I241T/G327N oluşturulmuştur. Bu çalışma, YojK-I241T/G327N'yi ekonomik olarak verimli endüstriyel ölçekte Reb D üretimi için umut verici bir araç olarak sunmaktadır.
