Fare siyatik sinirlerinde NAD+ ve metabolitlerinin nicelendirilmesi
Giriş
Nikotinamid adenin dinükleotidin (NAD+) ve metabolitlerinin yaşlanma ve nörodejenerasyondaki kritik kısımları geniş çapta tanınmıştır. Yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkları hedefleyen biyokimyasal araştırma ve müdahalelere ilerlemeyi teşvik etmek için, NAD+ ve metabolit seviyelerinin NAD+ kurtarma yolunda doğru şekilde nicelendirilmesi büyük öneme sahiptir. Burada, sağlam ve doğru bir LC-MS/MS yöntemi, normal ve yaralı fare siyatik sinirinde NAD+ ve metabolit seviyelerini nicelendirmek için uygulanır.NAD+ ve metabolitlerini niceleştirmek için mevcut yöntemlerin sınırlamaları
HPLC-UV, NMR, kapiler bölge elektroforezi veya kolorimetrik enzimatik testler gibi geleneksel NAD+ ve metabolitlerini nicelendirmek yöntemleri, hassasiyet, seçicilik ve dolaylı ölçüm açısından çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Hücresel veya doku NAD+ ve metabolit ölçümleri için mevcut LC-MS/MS testleri için hâlâ aşılması gereken birçok zorluk vardır; örneğin uzun çalışma süreleri, kötü kromatografik tutma davranışı ve tatmin edici olmayan zirve şekilleri. Ayrıca, NAD+ kurtarma yolunda sadece bir ila üç madde bu yöntemlerle kaplanabilir.LC-MS/MS yönteminin modifikasyonları
Mevcut LC-MS/MS testleri temelinde, kromatografik koşullar, taşıyıcı matris ve MS/MS koşullarıyla ilgili değişiklikler yapılır. Özellikle, 5 μM metilen fosfonik asit mobil faz katkısı olarak kullanılır ve bu da sinyal yoğunluğunu ve zirve şeklini açıkça destekler. Never sample'ın nispeten temiz ve basit yapısı ile küçük boyutları nedeniyle, ultra saf su bir alternatif matris olarak test edilir. Hidrofilik etkileşimli sıvı kromatografi kolonu ve hiperkarbonat kolonu yerine, benzersiz MaxPeak HPS yüksek performanslı yüzey teknolojisi (kolonun iç duvarını pasifleştirmek, metal yüzeyi ortadan kaldırmak) ile tüm analizlerin yüksek tekrarlanabilirliğini, zirve simetrisini ve baz ayırmasını sağlayan Waters Atlantis Premier BEH C18 AX kolonu kullanılır. Ayrıca, MS koşulları, döngüsel adenosin difosfat riboz (cADPR) kanalında NAD+ parazit sinyalini en aza indirecek şekilde optimize edilmiştir; aynı zamanda cADPR ve nikotinamid mononükleotit (NMN) yanıtını korurken; iyon püskürtme voltajı için 4000V, turbo ısıtıcı sıcaklığı için 450°C, gaz 1 için 50 psi, gaz 2 için 50 psi, perde gazı için 30 psi ve çarpışma gazı için 12 psi.
Sinir örneklerinin temsil kromatogramı (normal vs yaralı)
Beş analitin tamamı başlangıç ayrımına ulaşır; burada cADPR nörodejenerasyon modelinde hassas bir biyobelirteçtir. Burada, siyatik sinir aksotomisi aksonal dejenerasyonu indükler ve yaralı sinirlerde NAD+ seviyesinin düşmesine ve NMN seviyesinin yükselmesine yol açar; bu da NMN/NAD+ oranında yaklaşık 2 kat artışa yol açar. Aynı zamanda, nikotinamid (NAM) ve adenosin difosfat riboz (ADPR) seviyeleri yaklaşık 2 kat azalırken, cADPR seviyesi 8 kattan fazla artar. Bu sonuçlar, daha önce bildirilen araştırmalarla tutarlıdır ve bu değiştirilmiş LS-MS/MS yönteminin NAD+ ve metabolitlerini niceliklendirmede doğruluğunu doğrulamaktadır.
Sonuç
Bu modifiye edilmiş LC-MS/MS yöntemi, NAD+, NMN, NAM, ADPR ve cADPR'nin 5 dakikalık kısa sürede etkili bir başlangıç ayrımını sağlar; bu da çeşitli nörolojik bozuklukların erken teşhislerine ve yaşlanma ile nörodejeneratif hastalıklar için ilaç geliştirmeye katkı sağlar.Referans
Ma Y, Deng L, Du Z. Fare siyatik sinirlerinde NAD+ ve ilgili metabolitlerin nicelendirilmesi için LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması, ayrıca sinir hasarı hayvan modeline uygulanması. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC2012'den beri koenzim ve doğal ürünler için ham maddelerin Ar-Ge, üretimi ve satışına kendini adamıştır; kendi fabrikaları, 170'ten fazla küresel patenti ve güçlü Ar-Ge ekibi bulunmaktadır. BONTAC, biyosentezde zengin Ar-Ge deneyimine ve ileri teknolojiye sahiptir.NAD ve öncülleri(örneğin. NMN ve NR). Seçilecek çeşitli NAD türleri vardır; bunlar arasında NAD ER Derecesi (endoksin çıkarılması), NAD Derece I (IVD/diyet takviyesi/kozmetik ham tozu), NAD Derece II (API/ara ürünler) ve NAD Derecesi IV (çözünebilirlik gereksinimi yüksekse) yer alır; bunlar liyofilize toz veya kristal toz şeklinde sağlanabilir. BONTAC NAD'ın saflığı %98'in üzerine çıkabilir.
