Fare Siyatik Sinirlerinde NAD+ ve Metabolitlerinin Kantifikasyonu
Giriş
Nikotinamid adenin dinükleotidin (NAD+) ve metabolitlerinin yaşlanma ve nörodejenerasyondaki kritik rolleri yaygın olarak kabul edilmiştir. Yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkları hedefleyen biyokimyasal araştırmaları ve müdahaleleri ilerletmek için, NAD+ geri kazanım yolundaki NAD+ ve metabolit seviyelerinin doğru bir şekilde ölçülmesi büyük önem taşımaktadır. Burada, normal ve hasarlı fare siyatik sinirinde NAD+ ve metabolitlerinin seviyelerini ölçmek için sağlam ve doğru bir LC-MS/MS yöntemi uygulanmaktadır.NAD+ ve metabolitlerini ölçmek için mevcut yöntemlerin sınırlamaları
NAD+ ve metabolitlerini ölçmek için HPLC-UV, NMR, kapiler zon elektroforezi veya kolorimetrik enzimatik testler gibi geleneksel yöntemler, hassasiyet, seçicilik ve dolaylı ölçüm açısından çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Hücresel veya doku NAD+ ve metabolitlerinin ölçümü için mevcut LC-MS/MS testlerinde, uzun çalışma süreleri, zayıf kromatografik tutma davranışı ve yetersiz pik şekilleri gibi aşılması gereken birçok zorluk hala mevcuttur. Ayrıca, bu yöntemlerle NAD+ geri kazanım yolundaki yalnızca bir ila üç madde kapsanabilmektedir.LC-MS/MS yönteminin modifikasyonları
Mevcut LC-MS/MS testlerine dayanarak, kromatografik koşullar, vekil matris ve MS/MS koşulları ile ilgili modifikasyonlar yapılmıştır. Spesifik olarak, mobil faz katkı maddesi olarak 5 μM metilen fosfonik asit kullanılmıştır; bu, sinyal yoğunluğunu ve pik şeklini belirgin şekilde iyileştirir. Numunelerin nispeten temiz ve basit yapısı ve küçük boyutları göz önüne alındığında, vekil matris olarak ultra saf su test edilmiştir. Hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi kolonu ve hiperkarb kolonu yerine, benzersiz MaxPeak HPS yüksek performanslı yüzey teknolojisi (kolon iç duvarını pasifleştirerek metal yüzeyi ortadan kaldırır) sayesinde tüm analitlerin yüksek tekrarlanabilirliğini, pik simetrisini ve bazal ayırımını sağlayan Waters Atlantis Premier BEH C18 AX kolonu kullanılmıştır.Ayrıca, iyon sprey voltajı için 4000V, turbo ısıtıcı sıcaklığı için 450℃, Gaz 1 için 50 psi, Gaz 2 için 50 psi, perde gazı için 30 psi ve çarpışma gazı için 12 psi olacak şekilde, cADPR ve nikotinamid mononükleotid (NMN) yanıtını korurken siklik adenozin difosfat riboz (cADPR) kanalındaki NAD+ girişim sinyalini en aza indirmek için MS koşulları optimize edilmiştir.
Sinir numunelerinin temsili kromatogramı (normal vs hasarlı)
Beş analitin tümü, nörodejenerasyon modelinde hassas bir biyobelirteç olan cADPR'nin bazal ayırımını elde eder. Burada, siyatik sinir aksotomisi aksonal dejenerasyonu indükler, hasarlı sinirlerde NAD+ seviyesinin azalmasına ve NMN seviyesinin artmasına yol açarak NMN/NAD+ oranında yaklaşık 2 kat artışa neden olur. Aynı zamanda, nikotinamid (NAM) ve adenozin difosfat riboz (ADPR) seviyeleri yaklaşık 2 kat azalırken, cADPR seviyesi 8 kattan fazla artar. Bu sonuçlar, daha önce rapor edilen araştırmalarla tutarlıdır ve bu modifiye LC-MS/MS yönteminin NAD+ ve metabolitlerini ölçmedeki doğruluğunu doğrular.
Sonuç
Bu modifiye LC-MS/MS yöntemi, NAD+, NMN, NAM, ADPR ve cADPR'nin 5 dakikalık kısa bir çalışma süresi içinde etkili bazal ayırımını sağlar; bu, çeşitli nörolojik bozuklukların erken teşhisine ve yaşlanma ile nörodejeneratif hastalıklar için ilaç geliştirilmesine katkıda bulunur.Referans
Ma Y, Deng L, Du Z. Fare siyatik sinirlerinde NAD+ ve ilgili metabolitlerin ölçümü için bir LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması ve bunun sinir hasarı hayvan modeline uygulanması. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC2012'den beri koenzim ve doğal ürünler için hammadde araştırma-geliştirme, üretim ve satışına adanmıştır; kendi fabrikaları, 170'ten fazla küresel patenti ve güçlü Ar-Ge ekibiyle. BONTAC, biyosentez konusunda zengin Ar-Ge deneyimine ve ileri teknolojiye sahiptir.NAD ve öncüllerinin(örn. NMN ve NR) biyosentezinde zengin Ar-Ge deneyimine ve ileri teknolojiye sahiptir. Seçilebilecek çeşitli NAD türleri vardır: NAD ER Sınıfı (endoksin giderimi), NAD Sınıf I (IVD/diyet takviyesi/kozmetik ham tozu), NAD Sınıf II (API/ara maddeler) ve NAD Sınıf IV (çözünürlük konusunda daha yüksek bir gereksinim varsa); bunlar liyofilize toz veya kristal toz formunda sağlanabilir. BONTAC NAD'in saflığı %98'in üzerine ulaşabilir.
